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APORTACIONES ORIGINALES

Recibido: 22/10/2014

Aceptado: 15/05/2015

Detección de secuencias de semillas de microRNAs celulares dentro del genoma de los virus del papiloma humano

Detection of microRNAs seed sequences within human papillomavirus genomes

David Pineda-Gómez,^a Efraín Garrido,^b Pedro Chávez,^b Mauricio Salcedo^a

^aUnidad de Investigación Médica en Enfermedades Oncológicas, Hospital de Oncología, Centro Médico Nacional Siglo XXI, Instituto Mexicano del Seguro Social

^bDepartamento de Genética y Biología Molecular, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados, Instituto Politécnico Nacional

Distrito Federal, México

Comunicación con: Mauricio Salcedo

Teléfono: (55) 5627 6900, extensión 22706

Correo electrónico: maosal89@yahoo.com

En el presente trabajo reportamos por primera vez la existencia de secuencias semilla de diferentes microRNAs (codificados en humano y de otros virus) en el genoma de los virus de papiloma humano (VPH). Estas secuencias tienen un alto poder oncogénico y se encontraron mediante un análisis in silico basado en las secuencias de microRNAs depositadas en la base de datos de Sanger. Entre ellas se detectó una posible huella que consiste en la presencia de varias repeticiones de la semilla del microRNA 297 (miR-297) en la región LCR y que fue detectada en los tipos virales 16, 18, 33, 45 y 52. Además, se realizó la búsqueda de semillas en los tipos virales de bajo poder oncogénico 6 y 11 y se observó que esta posible huella está ausente en el tipo 11, si bien se localizaron repeticiones de la semilla de otro microRNA, miR-363. Con base en este hallazgo, además de que se detectaron semillas de otros virus en las diferentes regiones de los seis tipos virales, se abre la posibilidad de la existencia de un mecanismo de regulación de la expresión de genes celulares a través de la transcripción de las diferentes regiones del genoma de los VPH de alto poder oncogénico que contienen las diferentes semillas de microRNAs.

Palabras clave: MicroARN, VPH.

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In this paper we are reporting for the first time the presence of seed sequences of human and viral microRNAs embedded within both high and low risk human papillomavirus (HPV) genomes. These seed sequences have high oncogenic potential. They were found using an in silico analysis based on the microRNA sequences added to Sanger’s database. Among these sequences, it was observed a potential fingerprint harbouring several repeated sequences of microRNA 297 (miR-297) within the LCR region of HPV types 16, 18, 33, 45 and 52. Further analyses were performed for low risk HPV types 6 and 11 and we observed that the probable fingerprint was absent in HPV11, even when we detected other repeated sequences of miR-363. According to these findings, besides the fact that we detected the presence of microRNA sequences within HPV genomes, we suggest a common putative viral mechanism of gene expression regulation shared among human virus.

Keywords: MicroRNAs, HPV.

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Los microRNAs son pequeñas moléculas de RNA de una longitud de 22 a 24 nucleótidos de longitud que juegan un importante papel en la regulación de la expresión génica a nivel de traducción.¹ Ejercen esta función gracias a su capacidad de integrarse a los complejos silenciadores de la traducción, los cuales son dependientes de RNA de interferencia (RISC). Estos inhiben la traducción al unirse a moléculas específicas de RNA mensajero (RNAm), silenciándolas o bien dirigiéndolas a degradación. Se han detectado casi 10 000 secuencias de microRNAs en una amplia variedad de especies, pero solo en una fracción de estas se han logrado identificar y caracterizar sus blancos fisiológicos; sin embargo, se ha demostrado que algunos microRNAs detectados en humano tienen blancos, ya sea relacionados con la regulación de ciclo celular, con la expresión de factores de crecimiento o con el desarrollo del individuo.²

Los microRNAs también se han relacionado con el desarrollo de diferentes tipos de cáncer en el ser humano.¹ Su expresión se ha reportado en diferentes virus que infectan al humano y que desarrollan alguna patología.³ Aunque aparentemente este tipo de moléculas están ausentes en el genoma de los virus de papiloma humano (VPH), el cual es el principal agente etiológico del cáncer cervicouterino, en el presente trabajo reportamos la existencia de secuencias semilla de microRNAs en el genoma de diferentes tipos de VPH, las cuales han sido reportadas previamente en el genoma de otras familias de virus y en el humano.

Métodos

Se descargó de la página del Instituto Sanger la base de datos con las secuencias de microRNAs correspondiente a la versión 10.0 (http://www.microrna.sanger.ac.uk/).^4-6 Se clasificaron las secuencias de microRNAs en familias, de acuerdo con la similitud en sus secuencias y se procedió a seleccionar las secuencias semilla de cada uno de ellos (tomando los nucleótidos 2-8 en el extremo 5´) y a eliminar la redundancia de ellas, con lo cual se obtuvieron solamente 1253 semillas, cada una de ellas representativa de una familia (de estas semillas, 280 correspondieron a H. sapiens). A esta base de datos se le denominó Fam_miRNAs. A continuación, se descargaron de la página electrónica del National Center of Biotechnology Information (NCBI) las secuencias consenso de los genomas de VPH tipo 16 y 18 (NC_001526.1 y X01505, respectivamente) y de diferentes secuencias reportadas de los genomas completos de VPH6 (AF092932), -11 (EU918768, cepa LZod45-11), -33 (EU918766, cepa LZcc12-33), -45 (EF202164, cepa Qv25000) y -52 (X74481), todas en formato Fasta.

Se procedió a crear una hoja de cálculo en el programa Excel (parte de la suite Office de Microsoft, versión 2003) que permitiera detectar las diferentes semillas a partir de la base de datos Fam_miRNAs en el genoma de los VPH; se usó la función Encontrar, la cual requiere que en la misma hoja de cálculo se introduzca la secuencia del genoma viral de interés y las semillas contenidas en la base de datos Fam_miRNAs. La función generó un reporte, en el que se registraron aquellas semillas que se localizaban y la región viral en la cual se ubicaron. Con base en esta información, se generó una nueva base de datos, denominada miRNAs_VPH X, en la que la X representaba el tipo viral en el que se llevó a cabo la detección. Después de seleccionar las diferentes semillas de microRNAs de H. sapiens, se procedió a ubicarlas dentro de un mapa genético de los tipos virales; para ello se utilizó la secuencia génica de los virus cargada en el programa Word (suite Office de Microsoft, versión 2003) y el comando Buscar (que se ubica dentro de la opción Edición de la barra de herramientas), en el cual se introducía la secuencia de la semilla que se iba a localizar y el programa realizaba su detección en las diferentes regiones virales. Se procedió a marcar con diferentes colores las semillas, dependiendo de su origen (virales, diferentes a VPH y H. sapiens) y se anotó el número de copias de cada una de ellas, además de asentar cuáles semillas se sobreponían y cuáles se encontraban contiguas unas con otras.

Resultados

Con el objeto de trabajar con las secuencias genómicas representativas de cada uno de los tipos de VPH, se realizó la búsqueda de las secuencias en la base de datos Entrez de NCBI y esta únicamente arrojó las correspondientes a los tipos 16 y 18. De las otras secuencias de genomas virales buscadas, solamente se detectaron reportes de diferentes cepas, de las cuales se seleccionaron aquellas que contuvieran las secuencias genómicas completas.

Al aplicar la función Encontrar del programa Excel, se detectaron cantidades variables de semillas de microRNAs tanto de H. sapiens como de diferentes virus en los diferentes tipos virales de VPH analizados. El listado de las secuencias semilla correspondientes a los microRNAs de origen viral se encuentra en el anexo 1, mientras que en los anexos 2 y 3 se detallan las secuencias semilla de los microRNAs pertenecientes a H. sapiens detectadas en los tipos de VPH.

También se detectaron repeticiones de algunas de las semillas en diferentes regiones de los genomas, de las cuales la más notable fue la registrada en la LCR de la semilla del miR-297 en los tipos 16, 18, 33, 45 y 52. En el anexo 4 se muestran las regiones LCR de los diferentes tipos de VPH incluidos en este estudio, en las cuales se indica la posición de dichas repeticiones.

Discusión

Desde principios del siglo XXI en que los microRNAs fueron descubiertos en C. elegans se ha reportado un número cada vez mayor de secuencias de microRNAs en diferentes organismos y se ha demostrado que forman parte de un mecanismo de regulación de la expresión génica, el cual apenas ha comenzado a estudiarse.^7,8 Varias secuencias de microRNAs se han detectado en una variedad de virus patógenos, como en el caso de la familia Herpesviridiae y en algunos miembros de las familias de los poliomavirus y adenovirus.3 Más recientemente se ha reportado la presencia de microRNAs en el genoma del virus de la imunodeficiencia humana (VIH).⁹ Estos datos sugerirían que los virus también poseen este tipo de elementos de regulación génica.

Aunque se han realizado varios intentos por detectar secuencias compatibles con microRNAs en el genoma de los VPH, las diferentes estrategias han fallado y se ha reportado solamente el hallazgo de microRNAs celulares, como en el caso del VPH31¹⁰ y los intentos de detección en líneas celulares VPH+.¹¹ Después de estos reportes identificamos secuencias compatibles de microRNAs celulares dentro de los genomas de VPH. Desafortunadamente en su momento los datos no fueron aceptados para su publicación (V Villegas, M Salcedo, comunicación personal, 2011). Sin embargo, recientemente ha sido reportada la presencia de microRNAs en los VPH de los tipos 16 (seis candidatos en dos de ellos localizados en la LCR), 38, 45 y 68 (un candidato en cada uno de ellos).¹² Con este reporte mostramos y sugerimos que los VPH contienen secuencias de semillas de microRNAs compartidas por secuencias de microRNAs humanos y de otros virus.

En el presente trabajo se presenta un análisis in silico que se implementó como una estrategia de detección de posibles microRNAs conservados entre las diferentes especies registradas en la base de datos del Instituto Sanger y distintos genomas del VPH; para esto, se utilizaron herramientas contenidas en dos programas de la suite Office de Windows. La metodología mostrada se propone como una alternativa al uso de otros programas que requieren conocimientos básicos de programación y de realización de scripts, como en el caso de Perl. Esta estrategia ha sido utilizada exitosamente para la detección de las semillas de aproximadamente 100 microRNAs distintos que están codificados en H. sapiens y otros virus. No fue posible detectar secuencias completas de microRNAs maduros o de sus precursores (pre-miRNAs) en cualquiera de los genomas analizados al comparar las secuencias reportadas en la base de datos miRBAse. Dada la longitud de los genomas de los VPH, pensamos que existe la posibilidad de que estos virus hayan desarrollado la estrategia de mantener en su genoma solamente las semillas de los microRNAs que pueden reportarles algún beneficio para su supervivencia, regulando negativamente genes que codifican para proteínas supresoras de tumores o de reconocimiento del sistema inmunológico, o bien, permitiendo de manera indirecta la síntesis de proteínas oncogénicas por mecanismos como los reportados por Esquela-Kerschner et al.¹ Por otra parte, se ha demostrado la existencia de un corte de intrones y un empalme de exones alternativo para la generación de una variedad de RNAs regulatorios en el VPH16, como ha sido demostrado anteriormente,¹³ por lo cual sugerimos que, como parte de este mecanismo, podrían transcribirse ciertas regiones donde se localizan las diferentes semillas de microRNAs, lo cual generaría una molécula de RNA no codificante que le permitiría ejercer, así, una posible función regulatoria.

De ser cierto lo anterior, es probable que estas secuencias las hayan adquirido como consecuencia de la evolución conjunta del VPH y H. sapiens, como fue propuesto por varios autores para el VPH16 y 18,^14-17 y que pueden haberse conservado en el genoma viral como una estrategia de supervivencia que incluye evasión del sistema inmune y regulación del ciclo celular. Resulta intrigante, además, la presencia de semillas derivadas de microRNAs de otros virus que tienen como hospedero al humano, como es el caso del virus del sarcoma de Kaposi, el virus de Epstein-Barr o el citomegalovirus; podría especularse que todos estos virus comparten el mismo esquema de infección y una posible regulación de las funciones celulares. La baja o nula capacidad oncogénica de los VPH6 o 11 podría explicarse, al menos en parte, por este evento, ya que no pudo demostrarse una relación entre la evolución del virus y la aparición de las diferentes razas del hombre.¹⁸ Por otra parte, no se ha demostrado aún la existencia de una posible recombinación entre los diferentes tipos de VPH,¹⁷ por lo cual pensamos que la presencia de las semillas de microRNAs de humanos en el genoma viral es un evento causado por su coevolución.

En cuanto a los resultados del análisis bioinformático, existen claras diferencias en la cantidad de semillas presentes en los tipos de VPH de bajo y alto riesgo. Los primeros muestran pocas semillas de microRNAs de otros virus, si bien el tipo 11 muestra un número elevado de copias de estas. Los tipos de alto riesgo muestran un número mayor de semillas de este tipo y un menor número de copias, lo cual puede significar que se requiere de un mayor número de estas semillas para que el VPH induzca una lesión en su hospedero y, posiblemente, el desarrollo de algún tipo de cáncer en el cérvix. La baja cantidad de semillas de otros virus en los tipos de VPH de bajo riesgo, en consecuencia, podría explicar, al menos en parte, que estos VPH solo sean capaces de inducir lesiones intraepiteliales de bajo grado.

Existen semillas que se sobreponen entre sí en los diferentes tipos virales (como es el caso de la correspondiente al miR-297), las cuales están presentes en la región LCR de los VPH16, 18, 33, 45 y 52. Este evento puede tener los siguientes significados: 1) que dicha superposición lleve a la inactivación de las semillas, de manera que, al transcribirse la región genómica donde se localizan, se generaría un RNA mensajero que codifica para la proteína viral y que no codifica para RNAs pequeños regulatorios; o bien, 2) que la superposición de semillas genere un posible microRNA exclusivo del virus, el cual puede interactuar con varios RNA mensajeros que sean objetivo a la vez. Este último evento ha sido demostrado en algunos casos cuando un pre-miRNA es policistrónico, es decir, que codifica para dos o más microRNAs en un solo transcrito,³ o bien que están agrupados en tándem, como es el caso de un conjunto de microRNAs detectados en el cromosoma 19 en el humano.¹⁹ Inclusive, la longitud de este hipotético microRNA de VPH podría poseer sitios de unión adicionales al RNAm objetivo, los cuales podrían favorecer la estabilización de la interacción microRNA-RNAm y la subsecuente regulación. Quedaría por demostrar, mediante técnicas moleculares, la existencia de este tipo de moléculas y si alguna de estas dos hipótesis puede tener algún significado para la actividad viral.

En lo que respecta a las semillas de microRNAs presentes en H. sapiens, también se observan diferencias entre los tipos de VPH de alto riesgo. Las mayores similitudes entre estas permiten agrupar a los tipos 18 y 45, mientras que los tipos 16, 33 y 52 formarían otro grupo, lo cual está en concordancia con los árboles filogenéticos desarrollados a partir de la proteína L1.²⁰ Esto puede deberse a que las semillas compartidas se encuentran en secuencias o dominios altamente conservados entre los diferentes tipos virales y posiblemente reflejan un mismo potencial de inducción de lesiones en los VPH pertenecientes a los dos grupos.

La presencia de las repeticiones de las semillas de miR-297 en las LCR de los tipos virales de alto riesgo podría indicar que estas repeticiones forman un agrupamiento o clúster que es necesario para la regulación de la expresión del genoma viral o celular, dada la localización particular de estas semillas (la LCR). Acorde con lo anterior, la presencia de varias repeticiones de la semilla de miR-363 en la correspondiente LCR del VPH11 podría reflejar que es necesaria la presencia de repeticiones en dicha región, sin importar el microRNA particular al que pertenezcan, y este evento podría apuntar hacia una posible huella genética que permitiera identificar la presencia del VPH y diferenciarlo de otros virus que pudieran estar presentes en una misma muestra de tejido.

En resumen, en este trabajo se reporta una metodología sencilla para un análisis in silico que permitió detectar una variedad de semillas de microRNAs en el genoma de diferentes tipos de VPH. Esta estrategia de detección puede emplearse también para detectar secuencias de microRNAs conservados en genomas de otras especies, aun de aquellas que se encuentren en proceso de ensamble.

En conclusión, los virus de papiloma humano de alto poder oncogénico teóricamente comparten secuencias compatibles a microRNAs humanos y virales, lo que sugeriría mecanismos de regulación viral común. Estas secuencias al menos pueden presentarse en clústers o agrupamientos dentro de la región control LCR.

Agradecimientos

El presente trabajo se deriva de un proyecto aprobado por fondos sectoriales de CONACyT y el proyecto IMSS sobre la detección de microRNAs en los virus de papiloma humano.

Durante la realización del presente trabajo, David Pineda Gómez fue becario de CONACyT en el programa de Doctorado de Biotecnología y Biomedicina Molecular en la ENCB-IPN.

Nota aclaratoria: hace más de dos años enviamos a publicación el reporte de la existencia de microRNAs en los VPH a dos diferentes revistas indexadas y en ambas ocasiones fue rechazado. Sin embargo, en el 2013, fue publicado un artículo en la revista PLoS ONE que reportaba la presencia de los microRNAs en los VPH.

Referencias

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