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Recibido: 30/10/2013

Aceptado: 29/05/2014

Estudio de la clonalidad linfoide por medio del análisis de reordenamientos del receptor de antígeno

Clonality lymphoid study through rearrangement analysis of antigen receptor

Nicolás Villamizar-Rivera,^a Natalia Olaya^a

^aGrupo de Patología Oncológica, Instituto Nacional de Cancerología-ESE, Bogotá, Colombia

Comunicación con: Natalia Olaya

Teléfono: (1) 334 11 11, extensión 4222

Correo electrónico: nolaya@cancer.gov.co

Las proliferaciones linfoides malignas suelen ser clonales. La mayoría de las veces el potencial biológico de una lesión se establece por medio del análisis clínico y el estudio anatomopatológico, pero algunos casos son de difícil diagnóstico. Por otra parte, existen situaciones en las cuales se producen clones dominantes cuyo análisis es importante, tal como ocurre en enfermedades autoinmunes e inmunodeficiencias. Este artículo presenta de manera comprensible las técnicas principales para el estudio de la clonalidad en lesiones linfoides, es decir, el análisis de reordenamientos de genes del receptor de antígeno por medio de pruebas basadas en reacción en cadena de la polimerasa (PCR) multiplex.

Palabras clave: Linfomas, Leucemias, Cáncer, Reordenamiento génico, Evolución clonal.

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As a rule, malignant lymphoid proliferations are clonal. While most of the time the biological potential can be established through routine pathologic examination and auxiliary techniques, some cases are difficult to classify. Moreover, there are situations in which there are dominant clones whose analysis are important, such as occur in autoimmune diseases and immunodeficiency. This paper presents in an understandable way the main techniques for the study of clonality in lymphoid lesions, i.e. the analysis of rearrangements of antigen receptor genes by multiplex polymerase chain reaction (PCR) based tests.

Keywords: DNA rearrangements, Lymphoma, Leukemia, Neoplasm, Clonal evolution.

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La teoría en boga para explicar el desarrollo del cáncer es la evolución. Algunas células somáticas se seleccionan y prevalecen a pesar de la lucha por el espacio y los nutrientes, y de los mecanismos de control de la división celular y del envejecimiento.¹ La existencia de clones dominantes suele definir la enfermedad.

Las leucemias y los linfomas son cánceres originados en los linfocitos o sus progenitores; afectan cualquier topografía corporal y a personas de todas las edades. Para diagnosticarlos y clasificarlos, se evalúan la morfología, el inmunofenotipo y ciertas alteraciones genéticas.² En las proliferaciones linfoides maduras se determina la relación de expresión de cadenas λ y κ de las inmunoglobulinas.³

Estos métodos permiten clasificar la mayoría de las lesiones, pero en casos difíciles los pacientes sufren retraso en su tratamiento o son sometidos a procedimientos inadecuados. La cantidad de lesiones de clasificación incierta varía, según la experiencia del centro diagnóstico. Además, a veces es necesario establecer la relación clonal entre dos lesiones o realizar un seguimiento posterior al tratamiento.⁴

El rearreglo de los genes del receptor de antígeno es un proceso fisiológico a partir de cuyo estudio puede determinarse la clonalidad linfoide. Son candidatos a este análisis las proliferaciones de células B de clasificación difícil, todas las lesiones de células T, y aquellas que ocurren en pacientes transplantados, inmunodeficientes, con enfermedades autoinmunes o asociadas a linfoproliferación, tales como la enfermedad inflamatoria intestinal y la enfermedad celíaca.^5,6

Pretendemos introducir a los lectores en los principios científicos y de aplicación de la técnica para estudio de rearreglos de los genes de antígeno por medio de reacción en cadena de la polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés).

Reordenamiento del gen del receptor de antígeno

Los genes de las inmunoglobulinas (Ig) y el receptor de los linfocitos T (TCR) están presentes en todas las células del organismo, pero a la manera de un rompecabezas sin armar. Los loci que codifican las cadenas pesadas de las Ig, las cadenas ligeras κ y λ de Ig (figura 1A), así como las cadenas α, β, γ y δ del receptor de linfocitos (TCR, por sus siglas en inglés) se encuentran en cromosomas diferentes (figura 1B). Además, existen varias secuencias posibles para cada uno de los segmentos que constituyen la región variable del gen. Por estas razones, la organización germinal de cada uno de los genes no puede transcribirse en ARNm7.

Solo los linfocitos requieren convertir los fragmentos génicos apartados en genes funcionales para los receptores de antígeno y así generar diversidad antigénica. En cada linfocito, la recombinación somática elabora un exón que codificará la región variable a partir de la selección de un segmento variable V, un segmento de unión J y un segmento de diversidad D, así como la adición de nucleótidos N y P. El segmento D solo está presente en los loci de las cadenas pesadas de Ig y los loci β y δ son exclusivos del TCR (figura 2). La recombinación alélica VDJ se regula por medio de exclusión alélica; una vez que un alelo se ha reordenado, se envía una señal al otro para interrumpir el proceso.^7,8

Los reordenamientos se realizan por medio de pasos secuenciales e invariables:

1. Sinapsis: el mecanismo enzimático detecta las secuencias señal de la recombinación o RSS (por sus siglas en inglés). Estas constan de tres porciones: un heptámero de nucleótidos conservados, un espaciador de 12 o 23 nucleótidos variables, y un nonámero de nueve nucleótidos rico en AT. Los heptámeros son vulnerables a la VDJ recombinasa, un tetrámero constituido por las proteínas RAG 1 y 2. Estas enzimas son propias de los linfocitos en desarrollo y se encuentran inactivas durante la proliferación celular.
2. Escisión: son roturas en la doble cadena de ADN en las uniones entre la RSS y la secuencia codificadora. La unión entre los heptámeros se realiza eliminando el ADN entre ellos, o formando un bucle por inversión de las cadenas. Los extremos codificadores rotos finalizan por una horquilla cerrada.⁹
3. Apertura de las horquillas por medio de la enzima Artemisa, que es una endonucleasa, con el fin de que la enzima TDT añada nuevas bases en los extremos expuestos, aumentando la diversidad de las secuencias.
4. Unión y finalización por medio del sistema de unión de extremos no homólogo, un sistema de reparación de ADN presente en todas las células.

Más tarde, los linfocitos B maduros aumentan su repertorio combinatorial por medio de hipermutación somática, la cual ocurre en el centro germinal. Se caracteriza por la adición o sustracción de nucleótidos.⁸

Aún se ignora cómo un locus determinado se selecciona en un caso específico o por qué algunos fragmentos son elegidos con mayor frecuencia. En las neoplasias linfoides ocurren reordenamientos de uno u otro receptor independientemente del linaje de la lesión, pero durante el proceso fisiológico las regiones variables de las Ig son ensambladas en los linfocitos B, mientras que las regiones variables del TCR son acopladas solo en los linfocitos T.

Principios técnicos

Durante mucho tiempo se utilizó el Southern Blot. La técnica es muy específica pero laboriosa y sus exigencias limitan la aplicación, pues se requiere de alrededor de 20 µg de ADN de buena calidad.¹⁰ Desde hace diez años existe un grupo de protocolos basados en PCR, denominados BIOMED-2.⁴ Estos fueron desarrollados por un conjunto de laboratorios europeos, el cual más tarde conformó el consorcio EuroClonality;¹¹ una parte de los materiales necesarios puede adquirirse a empresas comerciales.¹² Han aparecido numerosas publicaciones acerca de su desempeño y otras que ofrecen mejoras de la técnica original.^13,14

Los reordenamientos de TCR, particularmente el repertorio TCR β, pueden evaluarse por medio de citometría de flujo (CF).¹⁵ El consorcio Euroflow propone un panel de 24 anticuerpos, los cuales determinan el 70 % de los dominios.¹⁶ Además, la CF permite hacer rápidamente una evaluación cuantitativa y dar seguimiento.3

El estudio de los reordenamientos génicos del receptor de antígeno exige un ejercicio multidisciplinario entre la patología, la CF, la genética y la biología molecular.¹⁷

Procedimiento técnico

Muestras

Los protocolos técnicos están diseñados para usarse en tejido fresco o congelado. Sin embargo, se han realizado con éxito en tejidos parafinados.^18,19 Por otra parte, la CF permite la utilización de sangre, médula ósea y otros fluidos. Para cualquier tejido, la condición es que contenga una cantidad representativa de células problema.^4,16

El patólogo escogerá el área de tejido que va a examinar. Si es del caso, realizará macro o microdisección de la muestra con el fin de enriquecerla en células problema, pero es importante que persistan poblaciones policlonales. Debe evitarse seleccionar regiones naturalmente oligoclonales, como los centros germinales de los folículos linfoides.

Los controles negativos son poblaciones policlonales de linfocitos, obtenidos a partir de sangre periférica o tejidos linfoides normales. Como controles positivos se usan líneas celulares comerciales con rearreglos conocidos o lesiones clonales caracterizadas.^4,20

Para facilitar la interpretación, es necesario contar con información sobre el caso de estudio: datos demográficos y clínicos, informe de patología, inmunofenotipo, presencia y cantidad de linfocitos reactivos, etcétera. Los tratamientos recibidos afectan los resultados; por ejemplo, la administración de anti CD20 dificulta la determinación de la clonalidad de células B, y algunas traslocaciones, tales como t(11; 14) y t(14; 18) pueden dar resultados falsos negativos, ya que involucran rearreglos aberrantes de IgH.²¹

Aislamiento de ácidos nucleicos y evaluación de la calidad

El tiempo de isquemia, los procedimientos de congelación y almacenamiento, y la inclusión en parafina afectan la calidad del ADN extraído a partir de los tejidos. Son importantes el tipo y el tiempo de fijación, el espesor del tejido, los procedimientos de extracción del ADN, y la presencia de inhibidores de la PCR.¹⁹

Las pruebas requieren ADN de alta pureza y baja fragmentación. Si se utilizan muestras frescas o congeladas, los métodos de extracción, tanto comercial como tradicional, funcionan bien, incluyendo el uso de extractores automáticos. En el caso del tejido en parafina, se recomienda el uso de formalina tamponada al 10 % como fijador y un cuidadoso control de los tiempos de fijación. Aunque los protocolos BIOMED-2 recomiendan el kit QIAMP DNA Mini kit (QIAGEN®), otras publicaciones sugieren extracción orgánica y purificación.^18,22 En cualquier caso, si se utiliza tejido en parafina se recomienda verificar que es amplificable al menos hasta 300 nucleótidos. El BIOMED-2 incluye un protocolo de amplificación que permite evaluar productos de varios tamaños, pero existen otras opciones.⁴

Selección de blancos

La selección de los fragmentos que se desea amplificar depende de la pregunta clínico-patológica y de la cantidad y la calidad del ADN extraído. En el caso de los tejidos parafinados, deberán casi siempre evaluarse los amplicones de menor tamaño. Además, la pregunta clínica ayuda, ya que la frecuencia y la distribución de los rearreglos varía según la taxonomía tumoral (cuadro I).

Si la cantidad de células linfoides en la muestra es baja, como en las infiltraciones de piel o intestino, es necesario ajustar las cantidades de ADN y realizar las pruebas por duplicado. Se propone un algoritmo para la selección de los blancos moleculares (figura 3).

Amplificación y análisis de los amplicones

No es posible detectar por medio de PCR todos los segmentos génicos posibles, ya que se requerirían demasiados primers y tubos. Por tal razón, se diseñaron grupos de PCR múltiplex que utilizan primers que reconocen la mayor parte de ellos y primers consensus que reconocen secuencias conservadas entre los fragmentos. No se requiere un termociclador especial.^4,16

El análisis de los productos de las PCR multiplex se hace por medio de electroforesis en gel de acrilamida o capilar. También se ha usado electroforesis microcapilar de alta resolución por medio del equipo Agilent 2100 bioanalyzer.²³ Puede hacerse el análisis de fragmentos de doble cadena (formación de heterodupletas) y el análisis de productos de una sola cadena. Con el fin de inducir la formación de heterodupletas, los productos de PCR multiplex se someten a calentamiento y enfriamiento rápido.²⁴ La presencia de un pico o banda dominante indica positividad para el rearreglo estudiado y plantea indirectamente la presencia de un clon (figura 4).⁴

Interpretación y dificultades

Es preciso conocer la estructura de los genes que se van a evaluar, sus patrones de reordenamiento y las variaciones de estos; además, se deben verificar los patrones de expresión de los controles (cuadro II). No debe utilizarse la técnica para determinar el linaje de la lesión. Además, los resultados experimentales deben ser reproducibles.²⁵

Ocurren eventuales falsos positivos o negativos en la aplicación de estas pruebas. Muchos de ellos pueden evitarse por medio del análisis juicioso. Por ejemplo, el evaluador puede enfrentarse con productos de PCR que no cumplen, con la talla esperada o productos múltiples. En el caso de muestras que contienen escasos linfocitos, pueden obtenerse picos únicos no específicos, lo cual se denomina pseudoclonalidad. Además los tejidos, incluso los tumorales, suelen tener un fondo policlonal normal, el cual, en caso de ser muy prominente, podría ser de difícil interpretación.

Los falsos negativos ocurren por varias razones:

• Se utilizan primers o iniciadores consenso; entonces, se amplifican alrededor del 80 % de los posibles segmentos, pero no todos.

• En las neoplasias de células B maduras del centro germinal, cuyas células pueden haber sufrido hipermutación somática, no habrá amplificación.

• La lesión está insuficientemente representada en el tejido examinado.⁴

La detección de uno o varios clones no implica la presencia de una neoplasia, razón por la cual insistimos en que los resultados deben interpretarse en colaboración con todas las disciplinas relacionadas con el paciente.¹⁷ Es posible recurrir a los servicios de EuroClonality para la interpretación de resultados confusos.¹¹

Aunque en México y América Latina algunos grupos tienen experiencia con la utilización de las técnicas, esta sigue siendo relativamente marginal.^26-29

Enfermedad mínima residual y reordenamientos

Los tratamientos actuales para las neoplasias no erradican, sino que reducen el número de células tumorales.³⁰ Con el fin de predecir y evitar una recaída clínica, se requiere detectar los blastos en fases subclínicas, lo cual se conoce como enfermedad mínima residual (EMR). Esta es un factor pronóstico importante en leucemias y linfomas. Sirve como seguimiento y para determinar la necesidad de trasplante.^31-33

La finalidad de las pruebas para determinación de EMR es detectar hasta el último blasto (cuadro II). Cuando la enfermedad se asocia con un daño genético específico, este puede utilizarse como marcador de EMR. Sin embargo, en algunos casos, como el del transcrito TEL-AML1, la mayoría de los afectados presentan remisión molecular luego de la inducción; al contrario, en el caso del BCR-ABL, la mayoría de los pacientes persisten positivos después de la inducción.³⁴

En el caso de las leucemias, la inmunofenotipificación por medio de CF y las técnicas de biología molecular para la determinación de reordenamientos de los genes del receptor de antígeno ofrecen una elevada sensibilidad. Para determinar EMR por medio de las pruebas de reordenamientos de Ig y TCR, se aplican los protocolos sobre una muestra diagnóstica, rica en células tumorales. Los más representativos se secuencian. A partir de los resultados se diseñan primers específicos y se ponen en marcha ensayos cuantitativos por PCR.³⁵ Un 30 % de los casos presentan evolución clonal y requieren seguimiento por varios rearreglos.³¹ Sin embargo, puede decirse que el rastreo es, por medio de esta técnica, no solo muy preciso sino personalizado.

Conclusiones

Aunque los procedimientos para confirmar la clonalidad linfoide a partir de la búsqueda de reordenamientos de los genes de receptor de antígeno se conocen y se han utilizado por decenios, es necesario que se extienda su uso y se establezcan intercambios entre las disciplinas con el fin de mejorar la atención a los pacientes.

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